间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

　　【摘要】  　　目的： 为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源，探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs） 的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法： 利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增， 激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达， 以含血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化， 观察细胞形态的变化，检测内皮细胞特异性标志物的表达。结果： MSCs 在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性， CD31、CD45 为阴性， 分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征，并表达内皮细胞特异性标志物CD31。结论： 骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。
　　【关键词】  骨髓； 干细胞移植； 大鼠Spragua-Dawley； 间充质干细胞； 诱导分化； 内皮细胞
　　［Abstract］ Objective: To explore methods of separating and culturing mesenchymal stem cells （MSCs） of rats in vitro and to study the differentiation capability of bone marrow MSCs into endothelial cells, so as to provide new source of seed cells for tissue engineering. Methods: MSCs were separated from bone marrow with density gradient centrifugation and wall sticking screening,and amplified in vitro. The surface antigens of MSCs were evaluated with confocal laser scanning microscope （CLSM）。The passage cells were induced by differentiation induation media containing VEGF and bFGF to differentiate into endothelial cells. The morphological changes of differentiated cells were observed, and their specific indicator of endothelial cells was detected. Results: After MSCs being propagated and amplified in vitro, CD44 and CD90 were positively expressed in them, while expression of CD31 or CD45 was negative. The differentiated cells demonstrated the character of endothelial cells under phase contrast microscope.The expression of endothelial cell specific indicator, CD31, was detected at the same time. Conclusion: Bone marrow mesenchymal stem cells can be induced into endothelial cell line in vitro.
　　［Key words］ bone marrow； stem cell transplantation; rats,Sprague-Dawley; mesenchymal cell； induced differentiation； endothelial cell
　　在治疗严重慢性缺血性疾病过程中，目前临床常规治疗方法常常无能为力，不能很好地解除患者的痛苦。自1999年以来，有学者提出了治疗性血管新生（therapeutic angiogenesis）的概念，即将外源性血管新生诱导因子转入缺血组织中促进其血管新生和侧支血管形成，包括血管生成（angiogenesis）和血管发生（vasculogenesis）［1］。目前，治疗性血管新生已经发展成为一种治疗缺血性疾病的新方法，其中干细胞扮演了重要的角色。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）自1966年Friedenstein［2，3］等人发现以来，多年研究结果表明，MSCs在体外能自我复制、多系分化，具有强大的增殖能力，可分化为骨、软骨、脂肪、韧带等多种间叶组织，可进行相应的组织修复。但目前关于MSCs是否能分化为成熟内皮细胞，研究尚不多见。故拟通过体外培养成年大鼠MSCs，并将其向血管内皮细胞方向诱导，使所得细胞具有内皮细胞特性，旨在为临床上骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性疾病和将来血管组织工程所需种子细胞来源提供新的实验依据。
　　1  材料和方法
　　1.1  材料
　　SD大鼠（清洁级，四川大学华西医学中心实验动物中心提供，雌性，约150 g）；胎牛血清（FCS，Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），血管内皮细胞生长因子（VEGF，invitrogen公司），碱性成纤维生长因子（bFGF, R&D公司）；FITC标记CD44、CD90、CD31、CD45抗大鼠单抗，Ⅷ因子山羊抗大鼠单抗（Santa Cruz公司），即用型SP免疫组织化学检测试剂盒（SP-9003，北京中杉金桥生物公司）。
　　1.2  大鼠MSCs的培养
　　本研究采用梯度离心法加贴壁筛选法。取SD大鼠，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股、胫骨，暴露骨髓腔。用低糖无血清DMEM培养液冲出骨髓，离心后弃上清液，以无菌PBS液稀释。取离心管，分别加入等量Percoll分离液（ρ=1.073 kg/L）和骨髓稀释液，离心30 min（3 000 r/min），仔细吸取白色单核细胞层，洗涤后用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的低糖DMEM培养基（pH=7.2～7.4）重悬，并调整细胞浓度至4×105/ml，接种于250 ml培养瓶，放入37 ℃、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养。7 d后全量换液，后每3 d换液1次。至14～16 d时，将融合生长约80%的细胞以0.25%胰酶-0.04%EDTA消化，按1∶3传代，定期取生长状态细胞进行倒置相差显微镜观察。
　　1.3  大鼠MSCs表面抗原检测
　　取生长已达到90％以上融合的P3代细胞，用0.25%胰酶-0.04%EDTA消化后，离心去上清液，无菌PBS液洗涤，4℃下4%多聚甲醛固定15 min后，再用PBS冲洗。分别加入1∶100稀释FITC标记的CD44、CD90、CD31、CD45单抗，于37 ℃下避光孵育30 min，DAPI复染细胞核，90%丙三醇封片，使用激光共聚焦显微镜观察。
　　1.4  试验分组及诱导分化
　　将P3代大鼠MSCs消化后按2.5×105/ml密度分为两组，即诱导组及对照组。诱导组换入含10%FCS、10 μg/L VEGF、4 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基进行内皮方向诱导分化；对照组换入新的含10% FCS低糖DMEM培养基。两组均放入37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养，每2 d换液1次。
　　1.5  内皮细胞特性的鉴定
　　两组均继续培养14 d后，取出细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，使用倒置荧光显微镜进行CD31免疫荧光检测，并计算其CD31阳性表达率。

作者：不详　来源：网络

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